برای زعفران آزمون های متعددی وجود دارد که در استاندارد ملی ۲-۲۵۹ تشریح شدهاند. لیست این آزمونها و نیز جرم نمونه مورد نیاز برای انجام هر یک از آزمون های زعفران رشتهای، رشتهای بریده و پودر زعفران در جداول ۶-۱۲ و ۷-۱۲ آورده شده است.
اولین آزمون , آزمون شناسایی میباشد که برای زعفرانهای رشتهای و رشتهای بریده از ذرهبین استفاده شده و برای زعفران پودر از یک واکنش رنگسنجی استفاده میشود. در صورت اثبات وجود ناخالصی در نمونهها، ادامه آزمونها ضرورتی ندارد.
ویژگیهای فیزیکی و شیمیایی پودر زعفران (استاندارد ملی ۱-۲۵۹، ۱۳۹۱)
| ردیف | ویژگیها | درجهبندی | روش آزمون | |||
| ممتاز | ۱ | ۲ | ۳ | |||
| ۱ | مواد خارجی (حداکثر درصد جرمی) | |||||
| ۱-۱ | مربوط به گیاه | ۱/۰ | ۱ | ۲ | ۲ | استاندارد ملی۲-۲۵۹ |
| ۲-۱ | مربوط به محیط | منفی | منفی | منفی | منفی | استاندارد ملی۲-۲۵۹ |
| ۲ | رطوبت و مواد فرار (حداکثر درصد جرمی) | ۸ | ۸ | ۱۰ | ۱۰ | |
| ۳ | خاکستر کل بر اساس ماده خشک (حداکثر درصد جرمی) | ۵/۵ | ۶ | ۷ | ۷ | استاندارد ملی۱۱۹۷ |
| ۴ | خاکستر نامحلول در اسید بر اساس ماده خشک (حداکثر درصد جرمی) | ۵/۰ | ۱ | ۱ | ۱ | استاندارد ملی۱۲۵۳ |
| ۵ | عصاره محلول در آب سرد بر اساس ماده خشک (حداکثر درصد جرمی) | ۶۵ | ۶۵ | ۶۵ | ۶۵ | استاندارد ملی۱۶۱۹ |
| ۶ | پیکروکروسین براساس ماده خشک (جذب در طول موج ۲۵۷ نانومتر)، حداقل | ۸۵ | ۸۰ | ۷۰ | ۷۰ | استاندارد ملی۲-۲۵۹ |
| ۷ | سافرانال بر اساس ماده خشک (جذب در طول موج ۳۲۰ نانومتر)، حداقل | ۵۰-۲۰ | ۵۰-۲۰ | ۵۰-۲۰ | ۵۰-۲۰ | استاندارد ملی۲-۲۵۹ |
| ۸ | کروسین بر اساس ماده خشک (جذب در طول موج ۴۴۰ نانومتر) حداقل | ۲۲۰ | ۲۰۰ | ۱۸۰ | ۱۵۰ | استاندارد ملی۲-۲۵۹ |
| ۹ | رنگهای افزودنی | منفی | منفی | منفی | منفی | استاندارد ملی۲-۲۵۹ |
برای اطمینان از تعلق نمونه به زعفران زراعی و احتمال وجود هرگونه مواد خارجی از آزمون میکروسکوپی زعفران استفاده میشود. اساس این روش شامل بررسی ماهیت و خلوص پودر زعفران و زعفران رشتهای خردشده و تعیین مواد خارجی و بقایای گل به وسیله تشریح میکروسکوپی میباشد. شیوه انجام این آزمون در استاندارد ملی ۲-۲۵۹ تشریح شده است (ا.م ۲-۲۵۹، ۱۳۹۱).
یکی دیگر از آزمونهای زعفران، آزمون تعیین درصد جرمی رطوبت و مواد فرار میباشد که طبق روش تشریح شده در استاندارد ملی ۲-۲۵۹ اساس آن عبارت از خشککردن نمونه در گرمخانه دارای دمای C°۲±۱۰۳ به مدت ۱۶ ساعت میباشد. پس از تعیین مقدار رطوبت و مواد فرار، از نمونه خشکشده جهت آزمون تعیین خاکستر کل و خاکستر نامحلول در اسید استفاده میشود. تعیین درصد جرمی خامه متصل به کلاله یکی دیگر از آزمونهای زعفران است که در خصوص زعفران رشتهای و رشتهای بریده اندازهگیری میشود. خامه متصل به کلاله در آزمون به صورت فیزیکی جدا شده و سپس با ترازوی دقیقی وزن میگردد.
آزمون تعیین درصد جرمی مواد خارجی در زعفرانهای رشتهای و رشتهای بریده صورت میگیرد. مواد خارجی مربوط به گیاه زعفران و مواد خارجی مربوط به محیط، بهطور جداگانه در یک آزمون به صورت فیزیکی جدا شده و سپس توزین میگردد. برای برخی از آزمونهای زعفران نیاز به ساییدن و الک کردن میباشد. برای این منظور باید از آسیابی با مشخصات بیان شده در استاندارد ملی
مراحل آزمون و جرم نمونه مورد نیاز جهت آزمون زعفران رشتهای و رشتهای بریده (ا.م ۲-۲۵۹، ۱۳۹۱)
| ردیف | مراحل آزمون(آزمونه: ۲۴=۲×۱۲ گرم) | آزمایه(گرم) | توضیحات |
| ۱ | آزمون شناسایی | ۵ | آزمایه جدید- آزمون غیرتخریبی |
| ۲ | بررسی میکروسکوپی | ۰۵/۰ | آزمایه از مرحله ۱ |
| ۳ | تعیین میزان مواد خارجی | ۳ | آزمایه از مرحله ۱ |
| ۴ | خامه متصل به کلاله | ۳ | آزمایه از مرحله ۱- آزمون غیرتخریبی |
| ۵ | تعیین عصاره محلول در آب | ۲ | آزمایه از مرحله ۴ پس از افزودن خامههای جداشده |
| ۶ | تعیین مقدار رطوبت و مواد فرار | ۵/۲ | آزمایه جدید- آزمونه را برای تعیین خاکستر کل و خاکستر نامحلول در اسید نگهداری کنید. |
| ۷ | تعیین خاکستر کل | ۲ | باقیمانده آزمایه از مرحله ۶ |
| ۸ | تعیین خاکستر نامحلول در اسید | – | آزمایه به دست آمده از مرحله ۷ |
| ۹ | ساییدن و الک کردن | ۴ | آزمایه جدید- نمونه را پس از ساییدن الک کنید تا پودری به دست آید که ۹۵ درصد کسر جرمی آن از یک الک یا روزنههای ۵۰۰ میکرون عبور کند. باقیمانده روی الک را مجدداً با نمونه زیر الک مخلوط کنید تا آزمونه یکنواختی به دست آید. |
| ۱۰ | تعیین خصوصیات اصلی کروماتوگرافی لایه نازک | ۵/۰ | آزمایه از مرحله ۹ بعد از الک کردن |
| ۱۱ | (TLC): شناسایی رنگهای مصنوعی | ۵/۰ | آزمایه مرحله ۹- قبل از الک کردن HPLC (مرحله ۱۲) میتواند به صورت |
| ۱۲ | کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا (HPLC): شناسایی رنگهای مصنوعی | ۵/۰ | جایگزین پا به صورت اضافی اجرا شود. در این صورت از محلول استخراج شده برای هر دو روش استفاده کنید. |
| ۱۳ | آلایندههای فلزی | ۵/۰ | آزمایه از مرحله ۹- قبل از الک کردن TLC (مرحله ۱۱) میتوانید به صورت جایگزین یا به صورت اضافی اجرا شود. در این صورت از محلول استخراج شده برای هر دو روش استفاده کنید. |
یادآوری: مقدار ۵/۴ گرم نمونه آزمایشگاهی باقی میماند که میتواند برای آزمونهای بیشتر یا برای تکرار آزمونهای معین مورد استفاده قرار گیرد.
۲-۲۵۹ و الک با چشمه ۵۰۰ میکرومتر استفاده شود. برای تعیین درصد جرمی عصاره محلول در آب سرد، از روش ارائه شده در استاندارد ملی شماره ۱۲۱۸۵ استفاده میشود (ا.م ۲-۲۵۹، ۱۳۹۱). منظور از درصد جرمی عصاره محلول در آب سرد، کل موادی است که به وسیله آب سرد از زعفران استخراج شده و برحسب درصد جرمی براساس ماده خشک محاسبه میگردد.
اساس کار این آزمون به این صورت است که عصاره از آزمونه زعفران به وسیله آب سرد استخراج میگردد و سپس محلول عصاره به دست آمده صاف، خشک و توزین میشود (ا.م ۱۲۱۸۵، ۱۳۸۸). خاکستر کل نمونه نیز مطابق با روش ارائه شده در استاندارد ملی شماره ۱۱۹۷ تعیین میگردد.
تعیین خاکستر نامحلول در اسید مطابق با دستورالعمل ارائه شده در استاندارد ملی ۱۲۵۳ میباشد (ا.م ۲-۲۵۹، ۱۳۹۱).
تعیین ویژگیهای اصلی نمونههای زعفران با استفاده از روش طیف نورسنجی فرابنفش – مرئی ممکن میباشد. این روش، اندازهگیری خصوصیات اصلی زعفران را که مرتبط با مقدار پیکروکروسین، سافرانال
مراحل آزمون و جرم نمونه مورد نیاز جهت آزمون زعفران پودر (ا.م ۲-۲۵۹، ۱۳۹۱)
| ردیف | مراحل آزمون (نمونه آزمایشگاهی ۱۲=۲×۶ گرم) حدود ۱۰ گرم | آزمایه(گرم) | توضیحات |
| ۱ | آزمون شناسایی | آزمایه جدید- اگر آزمایه در تجزیه رنگسنجی مورد تأیید قرار نگرفت آزمایش را ادامه ندهید. | |
| ۲ | بررسی میکروسکوپی | آزمایه جدید | |
| ۳ | تعیین میزان مواد خارجی | در کل بسته مورد آزمون، وجود مواد خارجی مورد بررسی قرار میگیرد | |
| ۴ | تعیین مقدار رطوبت و مواد فرار | آزمایه جدید- آزمونه را برای تعیین خاکستر گل و خاکستر نامحلول در اسید نگهداری نمایید | |
| ۵ | تعیین خاکستر کل | باقیمانده آزمایه از مرحله ۴ | |
| ۶ | تعیین خاکستر نامحلول در اسید | آزمایه به دست آمده از مرحله ۵ | |
| ۷ | ساییدن و الک کردن | آزمایه جدید- الک کردن را مطابق با بند ۸ انجام دهید تا پودری به دست آید که ۹۵ درصد کسر جرمی آن از یک الک با روزنههای ۵۰۰ میکرون عبور کند. باقیمانده روی الک را مجدداً با نمونه زیر الک مخلوط کنید تا آزمونه یکنواختی به دست آید. | |
| ۸ | تعیین محلول عصاره در آب سرد | آزمایه از مرحله ۷ | |
| ۹ | تعیین خصوصیات اصلی | آزمایه از مرحله ۷ بعد از الک کردن | |
| ۱۰ | کروماتوگرافی لایه نازک (TLC): شناسایی رنگهای مصنوعی | آزمایه مرحله ۷- قبل از الک کردن HPLC (مرحله ۱۱) میتواند به صورت جایگزین یا به صورت اضافی اجرا شود. در این صورت از محلول استخراج شده برای هر دو روش استفاده کنید. | |
| ۱۱ | کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا (HPLC): شناسایی رنگهای مصنوعی | آزمایه از مرحله ۷- قبل از الک کردن TLC (مرحله ۱۰) میتواند به صورت جایگزین یا به صورت اضافی اجرا شود. در این صورت از محلول استخراج شده برای هر دو روش استفاده کنید. |
یادآوری: مقدار ۱ گرم نمونه آزمایشگاهی باقی میماند که میتواند برای آزمونهای بیشتر یا برای تکرار آزمونهای معین مورد استفاده قرار گیرد.
مقایسه دو روش HPLC و طیف نورسنجی در نمونههای زعفران خشک شده با چهار روش مختلف بر حسب میلیگرم بر کیلوگرم (فلاحتپیشه و همکاران، ۱۳۸۳).
و کروسین است، امکانپذیر میسازد. اساس این روش بر مبنای ثبت تغییرات چگالی نوری عصاره آبی زعفران در طول موج بین ۲۰۰ تا ۷۰۰ نانومتر در دمای محیط میباشد. وسایل لازم و روش انجام این آزمون در استاندارد ملی ۲-۲۵۹ بهطور کامل تشریح شده است (ا.م ۲-۲۵۹، ۱۳۹۱). از آزمونهای دیگری که در خصوص زعفران انجام میشود آزمون تعیین آلایندهها است. اندازهگیری مقدار فلزات سنگین، از طریق هضم و آمادهسازی نمونه و سپس تزریق آن به دستگاه جذب اتمی انجام میگیرد. برای اندازهگیری باقی مانده سموم و آفتکشها در نمونه از روشهای HPLC و GC استفاده میشود.
آزمون ویژگیهای میکروبیولوژی زعفران نیز طبق استاندارد ملی ایران به شماره ۵۶۸۹ انجام میشود که در فصل ترکیبات شیمیایی و کاربردهای زعفران آورده شده است. از دیگر آزمونهای رایج در خصوص زعفران شناسایی رنگهای مصنوعی میباشد. در استاندارد ملی ایران به شماره ۲-۲۵۹ روش شناسایی رنگهای مصنوعی اسیدی محلول در آب به روش کروماتوگرافی لایه نازک (TLC)، روش شناسایی رنگهای اسیدی محلول در آب به روش کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC)، روش شناسایی رنگدانهها و مواد غیرقطبی توسط کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا و نیز روش شناسایی رنگدانهها و مواد قطبی توسط کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا بهطور کامل تشریح شده است (ا.م ۲-۲۵۹، ۱۳۹۱)، اندازهگیری ترکیبات زعفران با استفاده از روش کروماتوگرافی گازی با کارآیی بالا (HPLC) در مقایسه با روشهای طیفسنجی از دقت و تکرارپذیری بالاتری برخوردار است (جایمند و همکاران، ۱۳۸۹).
در تحقیقی فلاحتپیشه و همکاران (۱۳۸۳) مقدار سافرانال موجود در نمونههای زعفران خشک شده با روشهای گوناگون را با دو روش HPLC و اسپکتروفتومتری اندازهگیری کردند. با مقایسه نتایج به ویژه در نمونههای خشکشده با روش سنتی ارجحیت روش HPLC و نیز خطای احتمالی ناشی از همپوشانی سایر ترکیبات در اندازهگیری سافرانال به روش طیف نورسنجی مشخص گردید.
